晚期非小细胞肺癌分子检测面临的挑战

晚期非小细胞肺癌分子检测面临的挑战 [标签:url] [标签:科室] 摘要：最近CrispinTHiley等发表在Lancet杂志中的综述，重点介绍了分子检测非小细胞肺癌（Non-Small-CellLungCancer，NSCLC）的方法，即EGFR，ALK和PDL1检测方法所面临的挑战。 近十年来，科学家已经在肺癌诊断方面取得了很大进展。但是，利用分子检测技术鉴定具有临床价值的基因突变仍是十分具有挑战性的。最近CrispinTHiley等发表在Lancet杂志中的综述，重点介绍了分子检测非小细胞肺癌（Non-Small-CellLungCancer，NSCLC）的方法，即EGFR，ALK和PDL1检测方法所面临的挑战。 首先，我们先要确定肺癌的组织学类型。现已证明免疫组化标记能提高癌症组织学诊断的准确性。例如P63，P40，甲状腺转录因子TTF1，NapsinA和CK7等标记能帮助我们鉴定癌症组织学类型。然而，分析免疫组织化学结果需要专业的组织病理学经验和具有分析形态学环境的能力。 其次，肺癌细胞密度较低，且肺癌具有普遍转移性，因此很难获得大块组织样品。现在，晚期NSCLC活体取样主要使用电脑断层扫描经皮穿刺活检和超声波内窥镜活检，这些技术需要使用针头，而这会影响样品的质量和数量。支气管超声反式支气管针吸技术(EndobronchialUltrasoundTransBronchialNeedleAspiration,EBUS-TBNA)在采样时产生的创伤相对较小，且能够为疑似患者提供诊断和分析为一体的临床方案。然而，EBUS-TBNA获得的细胞学样本却无法提供癌症的形态学特征。使用针吸技术获得 细胞后，我们可以使用NGS技术进行突变分析。然而，全外显子测序（WholeExomeSequencing，WES）和全基因组测序（WholeGenomeSequencing， S)需要更大量的DNA样品，这对EBUS-TBNA技术构成了挑战。 EFGR分子诊断挑战 临床研究表明，EGFR突变影响癌症对EGFR酪氨酸酶抑制剂（TyrosineKinaseInhibitors,TKIs）的敏感性。EGFR基因发生Leu858Arg替换和外显子19缺失突变时，患者对TKI更敏感。然而随着用药时间延长，一些NSCLC敏感患者也会产生耐药性。而Thr790Met突变是NSCLC患者发生TKIs获得性耐药的主要原因。除此以外， 还有一系列其他机制来增强抗性，如扩增MET，选择性突变PIK3CA或BRAF。检测EGFR突变的方法有：传统Sanger测序，扩增抗拒突变系统，限制性片段长度多态性方法和NGS技术。然而在分析结果时我们必须清楚每种技术的局限性。对肺癌早期的瘤内异质性ITH研究表明，EGFR突变在最初发病部位和转移组织几乎不存在差异。而对TKIs抗药性的产生是因为癌细胞获得了二次突变。因此，在癌症进展时，我们需要获得实时样品来确定二线治疗方法，而这一过程的实施是非常具有挑战性的。其次，临床试验中一般采用较容易获得的受损组织，但是对于身体状况已经较差的病人，这一过程将会很复杂。最后，由于 的异质性，一个单一的样品是无法准确地代表所有抗药性机制，也无法代表不同发病位点癌细胞亚克隆产生的原因。 ALK融合基因分子检测 间变性淋巴瘤激酶融合基因（Anaplasticlymphomakinasefusiongene，ALK）这一致癌基因在NSCLC中扮演着重要角色。荧光原位杂交(Fluorescencein-situhybridization,FISH)是第一个被广泛应用于检测肺癌中ALK的方法。然而，该方法需要专业设备和有经验的操作者，且对样品的质量和数量要求较高。相对于杂交方法，免疫组化学检测方法使用抗体染色来检测ALK抗原的异常表达，这种方法的原理更简单更便宜。除此之外，NGS也可以用来检测ALK融合基因和其他基因的重排。与EFGR相似，ALK融合基因也被认为进行克隆性扩增。有研究表明，很小一部分 同时具有ALK融合基因和EGFR突变。使用ALK抑制剂治疗后，ALK通过多种机制产生抗药性。因此，实时活体采样和循环游离DNA（CellFreeDNA，cfDNA）分析将会帮助我们制定治疗方案。 分子检测PDL1遇到的挑战 PDL1是位于抗原提呈细胞或是癌细胞表面的配体，而PD1与PDL1受体的相互作用能够抑制T细胞效应反应。由于PDL1在NSCLC内的表达具有技术和空间异质性，无论NSCLC患者是否表达PDL1，都会对PDL1或PD1抗体治疗产生反应，因此PDL1还无法作为生物标记被使用。非同义单碱基突变能够产生新抗原，一个 所具有的新抗原可作为治疗的生物标记。研究表明，新生抗原的瘤内异质性能改变免疫点阻断治疗的效果，这使得临床试验复杂化。尽管PDL1的免疫组织化学已经被广泛应用于分析肺癌小样品。然而，ITH导致的取样偏差仍然构成很大的风险。因此，实时采样和重复采样能增加分析的准确性。然而，这会增加实验操作流程和加重患者的经济负担。 将多种NGS检测应用到临床中 突变特异性PCRs，Sanger测序和FISH技术已经被联合使用于大规模NSCLC致癌因子鉴定中。相比以上技术，NGS需要的样本DNA量较少，操作较简单且实验室操作时间较短。研究还表明，NSCLC患者之间的分子异质性也能够对治 果产生极大影响。然而，招募拥有稀有基因突变的患者进行不同层面的分子实验也是困难重重。多基因WESNGS实验将会成为未来的标准试验流程，然而对复杂基因组数据的解读和应用也将面临挑战。 未来解决办法 如何从少量的组织样品中获得更多的信息是NSCLC分子检测中最具挑战性的，因此提高NSCLC样品的质量是十分关键的。ITH和癌症进化将分别导致采样偏差和亚克隆变异，这些也是癌症对治疗具有抗性的原因。因为，尸体解剖研究（warmsautospy）需要从不同部位取得样品，这也许能帮助我们理解 异质性和癌症进化。当侵袭性活检技术不可行时，我们将会使用微创技术来获得样品，如cfDNA检测和液体活检。cfDNA检测方法已经被应用到检测EGFR突变，推断EGFRTKIs抗药性。由于循环癌细胞（Circulatingtumourcells，CTCs）能够从外周血液中获得，且细胞数量充足，因此可用来做检测。但是，相对于cfDNA检测，CTCs分离过程复杂，而且功能学和基因组学研究花费巨大。其他循环类核酸也具有巨大的应用前景。 总结 我们必须提高科研技术和更加深入地理解 生物学，才能应对NSCLC分子诊断发展中遇到的挑战。新一代分子诊断技术的实施和将其转化为临床实践都将面临很多问题。这就需要我们加强临床管理，信息科技基础设施建设，数据存储，样品的处理和训练以及专业知识的探索，如组织病理学，呼吸医学和 学。只有这样，我们才能将挑战转化为机遇来提高NSCLC药物研发的成功率和效率，最终帮助患者。